CINA - Center for Cellular Imaging and NanoAnalytics
L'établissement d'un centre d'imagerie cellulaire et de nanoanalyses, le C-CINA, s'inscrit dans la poursuite de l'objectif de SystemsX.ch visant l'obtention de données quantitatives sur les cellules et les organismes ainsi que la compréhension de systèmes biologiques. Ce centre fournira les techniques de mesure et d'imagerie adaptées à la biologie à l'échelle nanoscopique. Des outils de visualisation nanoscopique de cellules isolées seront développés afin de déterminer leur protéome avec des techniques de protéomique visuelle de haute capacité de traitement. De tels outils seront mis à la disposition des partenaires de SystemsX.ch et seront constamment développés en fonction des besoins de SystemsX.ch. Un savoir-faire de premier plan en sciences nanoscopiques est nécessaire pour ces analyses cellulaires dernier cri: basé à Bâle, le Centre National de Compétence en Recherche en Science Nanoscopique (NCCR) offre la meilleure expertise possible pour de tels développements. Le C-CINA deviendra partenaire dans ce consortium. En outre, le C-CINA collaborera étroitement avec le Department of BioSystems Science and Engineering (D-BSSE) de l'EPFZ. Le microscope électronique (ME) sert à visualiser des complexes supramoléculaires, des organelles et des cellules. La tomographie cryo-électronique de cellules vitrifiées est actuellement la seule méthode permettant d'appréhender dans le contexte cellulaire et au niveau nanoscopique la machinerie impliquée dans la transmission de signaux et la régulation génétique. Cette technique d'imagerie non-invasive n'a pas son pareil pour dévoiler l'architecture de systèmes biologiques.
Or, les cellules vitrifiées d'une épaisseur dépassant 1-2 µm diffusent le faisceau d'électrons et ne sont plus observables par tomographie électronique. Afin de pouvoir étudier le protéome de cellules isolées, nous allons donc développer des dispositifs microfluidiques permettant la culture de cellules dans des conditions reproductibles, leur perturbation, leur lyse et leur fractionnement ainsi que leur dépôt sur la grille du microscope électronique par un spotter. C'est le groupe Hierlemann du D-BSSE qui se chargera de construire ces appareils.
Le contenu d'une cellule entière devrait produire 500 à 50000 fractions de 10 picolitres (pL) de dilution adéquate, chacune constituant un point de 30 100 µm qui correspond à un carré de la grille. Comme chaque grille du ME contient plusieurs centaines de ces carrés, on pourra passer au crible le protéome complet d'une cellule avec une poignée de grilles seulement. Le ME va analyser ces points de façon automatisée et „lire“ les pages du livre qui représentent le protéome de la cellule. Compte tenu de la rapidité du processus microfluidique et de la stabilisation immédiate des complexes grâce à des réactifs de cross linking appropriés, l'état originel des n?uds moléculaires représentants des petits réseaux de signalisation a de grande chance d'être préservé dans un court laps de temps bien défini après la perturbation. Les échantillons obtenus pour le ME sont également assez fins pour une mesure à une résolution de 1 2 nm, ce qui permet l'identification des complexes moléculaires grâce à l'analyse en haute résolution de leur projections avec des algorithmes de reconnaissance de motifs avancés. Les anticorps marqués à l'or ainsi que les fragments FAB qui émettent des signaux distincts confèrent encore davantage de précision au processus d'identification. De tels échantillons peuvent ensuite être gelés, séchés et analysés au microscope électronique en transmission à balayage (STEM) qui révèle alors la masse des complexes déposés.
Ce pont entre la masse et la forme est la clé pour relier la spectrométrie de masse et les données structurelles; elle facilitera l'interprétation d'analyses protéomiques à grande échelle. Nous allons mener cette approche d'imagerie protéomique jusqu'à l'automation complète afin de la rendre compatible avec des analyses de haute capacité de traitement. Nous proposons également de la combiner avec la spectrométrie de masse de complexes cross-linkés dont les tailles se situent à l'échelle de méga-daltons en collaboration avec le laboratoire Zenobi de l'EPFZ et avec la pince optique multi-array développées par le laboratoire Vogel à l'EPFL. Le microscope optique (LM) a accompli d'importants progrès pour la visualisation de cellules vivantes, non seulement grâce aux modes d'imageries et à l'acquisition digitale des données, mais aussi au travers des protéines-chimères fluorescentes (FP) et d'autres protéines de marquage spécifiques.
Pour profiter des avantages de ces possibilités techniques, nous allons concevoir un système optique permettant d'observer des échantillons vitrifiés au microscope optique et d'identifier les zones d'intérêt pour la tomographie électronique. Un autre système optique devra permettre de suivre la trajectoire des complexes protéiques au moment du fractionnement dans le système microfluidique. Cependant, comme les résolutions couramment atteintes en microscopie optique et en tomographie électronique sont de l'ordre de 300 nm et 3 nm respectivement, il est nécessaire de recourir à la technique du „serial block face“ pour des analyses supra-structurelles avec des résolutions de 30 nm dans des échantillons de tissus atteignant des volumes de 300 µm3. Cette technique sera mise au point au C-CINA en collaboration avec le FMI. Le C-CINA obtiendra des informations concernant les protéomes cellulaires à plusieurs échelles et selon divers modes par l'usage d'un éventail de méthodes et d'instruments de mesure hétérogène. Ces données seront ensuite intégrées aux données obtenues avec d'autres techniques au sein du réseau SystemsX.ch, telles que les données de spectres de masse et de séquences génomiques.
Le groupe C-ISD de SystemsX.ch développe actuellement la banque de donnée biologique libre d'accès openBIS qui permettra aux scientifiques de gérer et d'explorer des données provenant de plusieurs disciplines organisées à l'intérieur d'un système hiérarchique logique. Le C-CINA maintiendra la banque de donnée de microscopie électronique expérimentale EMEN2 spécialisée dans les grands volumes de données et flux de traitement d'images requis par la microscopie électronique. Nous créerons une interface entre EMEN2 et openBIS de sorte à rendre les fonctionnalités d'EMEN2 accessibles depuis openBIS. Nous fournirons ainsi aux scientifiques de SystemsX.ch un système d'archivage, de visualisation, d'exploration de données sur les protéomes cellulaires cohérent.
